گلبولهاي قرمز
گلبولهای قرمز سلولهای بسیار مهمی هستند که بواسطه دارا بودن مولکول هموگلوبین، وظیفه اکسیژن‏رسانی به بافتهای مختلف را عهده‏دار می‏باشند. در بسیاری از مهره داران مانند خزندگان، پرندگان، ماهیها و... گلبولهای قرمز هسته‏دار بوده، حاوی میتوکندری و ریبوزوم نیز می‏باشند. یعنی این سلولها در تمام طول عمر خود به ساختن هموگلوبین مشغولند. در انسان گلبولهای قرمز موجود در گردش خون فقط در طی دوران زندگی جنینی بصورت هسته‏دار هستند و گلبولهای قرمز بالغ در انسان فاقد هسته، ریبوزوم و میتوکندری بوده، لذا قادر به ساختن هموگلوبین نمی‏باشند و هموگلوبین موجود در آنها طی مراحل اولیه تکامل سلولی در مغزاستخوان ساخته شده و در سیتوپلاسم ذخیره می‏گردد. از آنجاییکه گلبولهای قرمز موجود در خون را نمی‏توان جدا از پیشسازهای آنها در مغز استخوان دانست، مجموع گلبولهای قرمز و سلولهای سازنده آنها را بصورت بافت واحدی در نظر گرفته و به آن Erythron می‏گویند و به مجموعه گلبولهای قرمز خون محیطی Red Cell Mass اطلاق می‏شود.

مراحل تولید گلبولِ قرمز:
به روند تکثیر و تمایز سلولهای رده قرمز از مرحله بلاستیک تا تشکیل گلبول قرمز بالغ اریتروپوئز اطلاق می‏گردد. بطور کلی اریتروپوئیز به ترتیب ذیل می باشد:
پرونورموبلاست ← بازوفیلیک نورموبلاست ← پلی کروماتوفیلیک نورموبلاست ← اورتوکروماتوفیلیک نورموبلاست ← رتیکولوسیت ← اریتروسیت

در روند اریتروپوئز بتدریج اندازه سلولها کوچکتر، اندازه هسته کوچکتر، هسته متمایل به کناره سلول، نسبت N/C کمتر و کروماتین هسته فشرده‏تر و پررنگ تر می‏شود. بطور کلی در سیر تکامل اریتروسیتها، از زمانیکه یک پرونورموبلاست شروع به تکثیر توأم با تمایز می‏کند تا به RBC بالغ تبدیل شود، حدود 6-4 روز وقت لازم است که 3 روز آن تکثیر توأم با تمایز در مغزاستخوان است و این سه روز تحت تأثیر اریتروپوئیتین کوتاه نمی‏شود. در مدت این سه روز ابتدا یک پرونورموبلاست تکثیر همراه با تمایز انجام می‏دهد و به دو عدد بازوفیلیک نورموبلاست تبدیل می‏شود. این سلولها به ترتیب و به نوبه خود تکثیر همراه با تمایز انجام داده، ابتدا 4 پلی کروماتوفیلیک نورموبلاست و سپس 8 اورتوکروماتوفیلیک نورموبلاست بوجود می‏آید. در سلول اخیر تکثیر صورت نمی‏گیرد و فقط تمایز دارد و لذا 8 اورتوکروماتوفیلیک نورموبلاست به 8 رتیکولوسیت تبدیل می‏شوند. بنابراین از ابتدا تا تبدیل به رتیکولوسیت، 3 روز طول خواهد کشید. اریتروپوئیتین روی CFU-E اثر گذاشته و تکثیر آنرا زیاد می‏کند، اما این مدت را کم نمی‏کند. 3 روز بعد عمر رتیکولوسیت است. رتیکولوسیت دو روز از عمر خود را در حالت طبیعی در مغزاستخوان می‏گذراند و یک روز را در خون محیطی. این مدت تحت تأثیر اریتروپوئیتین است. یعنی اریتروپوئیتین از عمر رتیکولوسیت در داخل مغزاستخوان کم کرده و بر مدت زمان عمر آن در خون محیطی می‏افزاید. بنابراین کل این رویداد، 6 روز طول می‏کشد؛ اما بسته به میزان اریتروپوئیتین ممکن است 6-4 روز طول بکشد تا محصولات پرونورموبلاست وارد خون محیطی شود که یا بصورت RBC بالغ است و یا بصورت رتیکولوسیت.
* طول عمر RBC بالغ نیز به طور متوسط 120 روز است.
* در حالت طبیعی حدود10% از کل گلبولهای قرمز ایجاد شده در مغزاستخوان قبل از ورود به خون محیطی منهدم می‏شوند. به این امر خونسازی غیرموثر گفته می‏شود که در بعضی از بیماریها مانند آنمی مگالوبلاستیک افزایش می‏یابد.


غشاء گلبول قرمز
از لحاظ ترکیب، غشاء گلبول قرمز شامل50% پروتئین، 40% لیپید و10% کربوهیدرات می‏باشد و از لحاظ ساختمانی شامل دو لایه فسفولیپیدی است که در لابه‏لای آن مولکولهای پروتئین و کلسترول قرار گرفته‏اند:
1)
مولکولهای فسفولیپید دارای یک سر آب گریز (هیدروفوب) و یک سر آبدوست (هیدروفیل) هستند و دو لایه فسفولیپید طوری قرار می‏گیرند که سرهای هیدروفوب آنها بر روی همدیگر واقع می‏شوند و سرهای هیدروفیل به سمت خارج و داخل سلول قرار می‏گیرند و به این ترتیب به صورت دو ورقه چسبیده بهم در می‏آیند.
2)
لابه‏لای مولکولهای فسفولیپید مولکولهای کلسترول قرار دارند که در ورقه خارجی غشاء تراکم آنها بیشتر است. این مولکولها در ایجاد قابلیت انعطاف پذیری غشاء نقش مهمی ایفا می‏کنند.
3)
نوع دیگری از مولکولهای چربی در غشاء RBC یافت می‏شوند که متصل به مولکولهای قندی بوده و گلیکولیپید نامیده می‏شوند. همچنین مولکولهای دیگری بنام گلیکوفورین وجود دارند که ترکیب پروتئین و قند هستند. گلیکولیپیدها و گلیکوفورینها خاصیت آنتی‏ژنیک داشته و در واقع آنتی‏ژنهای گروههای خونی را تشکیل می‏دهند.
4)
پروتئینهای غشاء RBC را می‏توان به دو گروه تقسیم نمود:

الف- پروتئینهای Integral: پروتئینهایی هستند که تماما در ضخامت غشاء سیتوپلاسمی قرار گرفته‏اند یعنی یک سر این پروتئینها در داخل سلول و یک سر آنها در خارج سلول قرار می‏گیرد. مهمترین پروتئین این دسته عبارت است از پروتئین موسوم به پروتئین باند 3 که این پروتئین کانال عبور آنیونها مانند کلر و بیکربنات می‏باشد.

ب- پروتئینهای ساختمانی Structural: پروتئینهایی هستند که در سمت داخل غشاء سیتوپلاسمی قرار دارند و اسکلت و داربست اصلی ساختمان RBC را تشکیل می‏دهند. مهمترین پروتئین ساختمانی اسپکترین است که بصورت زنجیره‏های دوتایی در هم پیچیده، بلافاصله در زیر غشاء قرار می‏گیرد. طبیعی بودن ساختمان مولکولی اسپکترین جهت حفظ شکلِ طبیعی RBCها ضروری است. برای مثال در بیماری اسفروسیتوز ارثی که نوعی کم‏خونی همولیتیک است، اشکال اصلی در زنجیره‏های اسپکترین می‏باشد.
5) بر سطح گلبولهای قرمز نوعی مولکول قندی خاصی بنام اسیدسیالیک وجود دارد که دارای بار منفی می‏باشد. وجود همین بار منفی موجب می‏شود که RBCها در حالت نرمال فاصله‏ای حدود 25 نانومتر با هم داشته باشند و همچنین مانع از چسبیدن RBCها به جدار رگهای خونی می‏گردد.

گلبولهای قرمز و مقاومت در برابر اکسیداسیون
اکسیژنی که توسط گلبول قرمز حمل می‏شود و همچنین مواد اکسید کننده‏ای که انسان همه روزه با آنها سر و کار دارد (مانند باقلا، آسپرین، سولفونامیدها و داروهای ضد مالاریا)، می‏توانند به RBC آسیب بزنند. این آسیب بدلیل ایجاد مشتقات پرانرژی اکسیژن مانند H₂O₂ و رادیکالهای آزاد اکسیژن مانند یون سوپراکسید (¯O₂) و یون OH و اثر آنها بر RBC می‏باشد. حساسترین مناطق آسیب پذیر RBC در برابر اکسیداسیون عبارتند از: آهن دوظرفیتی موجود در هموگلوبین، پروتئینهای غشاء و آنزیمهای دارای گوگرد. اما گلبول قرمز طبیعی دارای سیستمهایی است که از ایجاد این آسیب ممانعت می‏کنند یا آنرا به حالت اول برمی‏گردانند:
1- چنانچه ⁺⁺Fe به ⁺⁺⁺Fe تبدیل شود، آنزیم Cytochrome-b₅-reductase، آهن فریک را احیاء کرده و به حالت اول یعنی فرو برمی‏گرداند. کوآنزیم این آنزیم NADH است که از مسیر گلیکولیز تأمین می‏شود.
2- سیستم دیگری موسوم به گلوتاتیون کاربرد موثری در این رابطه دارد.
گلوتاتیون یک تری‏پپتید است که از سه اسید آمینه گلیسین، سیستئین و گلوتامیک اسید تشکیل شده است و گوگرد موجود در سیستئین آن بصورت گروه سولفیدریل (SH-) می‏باشد. در زمان برخورد با مواد اکسید کننده، دو مولکول گلوتاتیون به کمک هم وارد عمل شده و از محل گروه سولفیدریل‏شان، اکسید شده و به هم متصل می‏شوند. به این ترتیب گلوتاتیون که در حالت احیاء شده (G-SH) بود، با ماده اکسید کننده واکنش داده و بصورت گلوتاتیون اکسید شده (G-S-S-G) درآمده و در نتیجه ماده اکسید کننده را خنثی می‏سازد.
گلوتاتیون اکسید شده مجددا توسط آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز و کوآنزیم NADPH₂ احیاء شده و جهت مقابله با مواد اکسید کننده بکار می‏رود. NADPH₂ از مسیری موسوم به پنتوزفسفات یا هگزوزمنوفسفات یا مسیر آلترناتیو تامین می‏شود. در این مسیر آنزیمِ G₆PD، روی گلوکز6 فسفات اثر کرده و موجب تولید NADPH₂ می‏گردد. در کمبود آنزیم G₆PD بعلت عدم تولید NADPH₂ و در نتیجه عدم تولید گلوتاتیون احیا، RBC نسبت به عوامل اکسید کننده حساس شده و زنجیره‏های پروتئینی گلوبین دناتوره می‏گردند و در مجاورت غشا سلول رسوب کرده و منجر به آسیب غشا و همولیز می‏شوند. اگر این گلبولهای قرمز را با رنگهای حیاتی مانند کرزیل بلو رنگ کنیم، ذرات هموگلوبین دناتوره بصورت اجسام متراکم متصل به غشا موسوم به اجسام هاینز مشاهده می‏شوند.

الکترولیتهای گلبول قرمز
مانند همه سلولهای بدن، غلظت پتاسیم داخل RBC بسیار بیشتر غلظت پتاسیم مایع خارج سلولی می‏باشد و مقدار سدیم آن بسیار کمتر از غلظت سدیم خارج سلولی است. وجود اختلاف غلظتهای فوق برای بقای RBC ضروری است. لذا در هر RBC حدود 300 عدد پمپ Na-K وجود دارد که بطور فعال و با مصرف انرژی، سدیم را از سلول خارج کرده و پتاسیم را به آن وارد می‏کند (یعنی بر خلاف شیب غلظت عمل می‏کنند). غلظت یون کلسیم داخل سلولی نیز بسیار کمتر از کلسیم خارج سلولی است (مانند سدیم) و RBC مجهز به پمپهایی است که بطور فعال و با مصرف ATP کلسیم را از داخل به خارج می‏راند.





روش كار:
ابتدا در يك ارلن مقداري NaCl 1 درصد تهيه مي كنيم . بدين صورت كه يك گرم از NaCl را با 100 cc آب مقطر به حجم مي رسانيم . سپس 11 لوله ي آزمايش را مطابق جدول زير پر مي كنيم .

بعد از پر كردن لوله ها به هر لوله توسط قطره چكان يك قطره خون اضافه مي كنيم .سپس درب لوله هاي آزمايش را با استفاده از پارافين مي پوشانيم و يك بار لوله ها را سرو ته مي كنيم. 11 لوله ي اول را حدود 3 دقيقه در سانتريوفيوژ قرار داده و 11 لوله ي بعدي را روي ميز كار مي گذاريم . بعد از خارج كردن لوله ها از سانتريوفوژ آنها را با هم مقايسه مي كنيم .
* نتيجه گيری :
مشاهده كرديم ، لوله هايي كه سانتريوفوژ نشده بودند به ترتيب از لوله ي 1 تا 11 رنگ محلول ها از كدر به شفاف تغيير كرده بود . همانطور كه مي دانيم اگر در يك محلول خوني هموليز انجام نشود محلول كدر خواهد بود و از آنجايي كه محيط محلول ها به ترتيب از 1 به 11 شباهت خود را نسبت به محيط داخلي گلبول هاي قرمز از دست مي دادند ، محلول ها شفافتر شده در نتيجه هموليز از لوله ي 1 تا 11 افزايش يافته . در واقع هر چه محلول هيپوتونيك تر شود آب به درون گلبولهاي قرمز نفوذ كرده ،تورژسانس انجام شده و غشاي گلبولهاي قرمز پاره مي شود و هموگلوبين از گلبول قرمز خارج خواهد شد.
محلولهايي كه سانتريوفوژ شده بودند به ترتيب از لوله ي 1 تا 11 ميزان تهنشين شدن خون كاهش يافته يعني هموليز به خاطر هيپوتونيك شدن محلول افزايش يافته .
لوله ي 4 مينيمم مقاومت را در برابر هموليز و لوله ي 7 ماكزيمم مقاومت را نشان مي دهند .چرا كه شرايط محيطي در لوله ي 4 شباهت بيشتري به شرايط خون دارد نسبت به لوله ي شماره ي 7.
*

سوال :
چرا مقاومت گلبولهای قرمز افراد دربرابر همولیز متفاوت است ویا در افراد مختلف برحسب سن ، جنس و...؟

گلبولهای قرمز در معرض آسیب اکسیداتیو هستند، زیرا فشار اکسیژن در این سلولها زیاد است و حضور مقادیر زیاد اسیدهای چرب غیر اشباع و یونهای آهن، موجب فراهم شدن شرایط مناسبی برای انجام واکنش های رادیکال آزاد می شود. همچنین اریتروسیت ها در تماس با منابع داخلی و خارجی رادیکالهای آزاد هستند. از جمله عوامل داخلی تبدیل مداوم اکسی هموگلوبین به متهموگلوبین، به میزان ۳% از کل هموگلوبین در روز است که سپس منجر به تولید رادیکالهای آزاد می شود. از جمله عوامل خارجی می توان گرانولوسیت ها، ماکروفاژها و سایر سلولهای فعال را نام برد که مرتباً پر اکسید هیدروژن و آنیون سوپر اکسید تولید می کنند که وارد پلاسما شده بر گلبول های قرمز اثر می گذارند. بنابراین تعجبی ندارد که گلبولهای قرمز مجهز به مکانیسم های دفاعی قوی بر علیه ROS باشند که متشکل از کاتالاز، گلوتاتیون پر اکسیداز، و سوپراکسید دیسموتاز است.علاوه بر این آنزیم های مسیر پنتوز فسفات برای تأمین مقادیر کافیGSH، آنزیم های پروتئولیتیک برای حذف پروتئین های اکسید شده و همچنین مقادیر زیادی ویتامین C و E نیز در این سلولها وجود دارد(Davies and Goldberg, 1987).



اگر چه مکانیسم های ترمیم ساختار چربی در اریتروسیت ها وجود دارد، ولی توانائی ترمیم یا جایگزینی پروتئین های اکسید شده محدود است. اگر اریتروسیت ها قادر به دفاع کامل و کافی از خود در مقابل رادیکالهای آزاد نباشند، آسیب دیده و تخریب می گردند که در نهایت آنمی همولیتیک ظاهر می شود.
در شرایط استرس اکسیداتیو، اسیدهای چرب غیر اشباع آمادگی بیشتری برای اکسید شدن دارند و بعلت نقش اساسی آنها در انعطاف پذیری غشاء، نهایتاً ساختار غشاء صدمه دیده همولیز ایجاد می شود. میزان صدمه اکسیداتیو بستگی به غلظت عوامل پراکسیدان و آنتی اکسیدان و نوع اسیدهای چرب غشایی دارد(Clemens, 1987). اریتروسیت نوزادان نسبت به صدمات پراکسیداتیو و تشکیل MDA حساس تر است. در محلول پراکسید هیدروژن، اریتروسیت های نوزادان قابلیت و آمادگی بیشتری برای همولیز دارند(Gordon and Smith, 1980). برای مقابله با اثرات سمی H₂O₂ فعالیت آنزیمهای گلوتاتیون ردوکتاز، پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز و کاتالازو وجود مقادیر کافی ازNADPH وگلوتاتیون ضروری است. کاهش گروههای سولفیدریل غشاء و کاهش مقدار آنتی اکسیدان های غشا نسبت به اسیدهای چرب غیر اشباع نیز موجب افزایش صدمات اکسیداتیو می شود، بطوریکه میزان [۱]TBARS در اریتروسیت های بند ناف در حدود دو برابر بالغین است. محصولات لیپید پراکسیداسیون از جمله مالونیل دی آلدئید موجب کاهش سیالیت و انعطاف پذیری غشاء و کوتاه شدن عمر اریتروسیت ها می شوند. خون بند ناف نه تنها در شرایط in vitro نسبت به استرس اکسیداتیو حساس تر است، بلکه در طی متابولیسم طبیعی در in vivo نیز حاوی محصولات پراکسیداسیون است.
گلبول‌های قرمز ما در معرض آسیب‌های اکسیداتیو هستند، زیرا فشار اکسیژن در این سلول‌ها زیاد است و حضور مقادیر زیاد اسیدهای چرب غیراشباع و یون‌های آهن، موجب فراهم شدن شرایط مناسبی برای انجام واکنش‌های رادیکال آزاد می‌شود.
همچنین گلبول‌های قرمز به دلیل گردش در بدن در تماس با منابع داخلی و خارجی رادیکال‌های آزاد هستند. زندگی در کلان شهرها و تنفس هوای آلوده، مصرف مواد غذایی حاوی نگه‌دارنده و رنگ‌های خوراکی، تماس با مواد شیمیایی و استرس بالا در زندگی امروز، همه و همه عواملی هستند که در بدن ما تولید رادیکال‌های آزاد می‌کنند. این رادیکال‌ها موجب تغییر ترکیبات گلبول قرمز می‌شوند.
اسیدهای چرب غیر اشباع آمادگی بیشتری برای اکسیدشدن دارند و به علت نقش اساسی آن‌ها در انعطاف پذیری غشاء، تخریب آن‌ها موجب صدمه دیدن ساختار غشاء و همولیز آن‌ها می‌شود. البته گلبول‌های قرمز مجهز به مکانیسم‌های دفاعی قوی بر علیه رادیکال‌های آزاد هستند ولی توانایی ترمیم یا جایگزینی پروتئین‌های اکسید شده محدود است
انجام فعالیت‌های شدید و فرآیند پیر شدن در سلول‌ها نیز موجب افزایش تولید رادیکال‌های آزاد می‌شود.
همولیز ممکن است تحت تاثیر عوامل مختلفی انجام شود مثل فشار اسمزی ، مواد شیمیایی مثل الکل ، سم مارها و همولیزین و تزریق نامتجانس.
بزرگ شدن طحال- بیماری فاویسم- وجود برخی پادتن ها- برخی داروها-نقص آنزیمG6PDمی تواند از عوامل همولیز یا شکنندگی گلبولها باشند.
همچنين با افزایش سن گلبولهاي قرمز ، از مقدار آنزیم های آنها کم و غشا شکننده می شود. این گلبول ها هنگام عبور از مویرگ های باریک کبد و طحال از بین می روند .
به طور كلي مي توان گفت راديكالهاي آزاد ، سن گلبولهاي قرمز ، فشار اكسيژن ، فشار اسمزي و عوامل بسياري در هموليز در افراد مختلف و يا حتي در يك فرد دخالت دارند.
اگر گلبولهاي قرمز يك فرد را در نظر بگيريم هرچه سن گلبولها بيشتر باشد هموليز آنها افزايش مي يابد.